美國Biostone塞尼卡谷測試劑盒
AsurDxTM Senecavirus A (SVA) Antibody Test Kit
一、概述
試劑盒用于檢測豬血清或者血漿中Senecavirus A A (SVA)體。試劑盒原理是基于間接ELISA方法，酶標板上已經包被SVA蛋白重組原，添加樣品后，樣品內的體能與板上包被原特異性結合形成原體復合物，并與后面加入的酶標二結合，二上的酶再催化底物顯色，顯色深度與樣品中的體含量成正相關。
二、試劑盒規格及組分
試劑盒組分 | 10039-02 | 10039-05 | 儲存溫度 |
原包被板SVA antigen-Coated Plate | 2*96 | 5*96 | 4°C |
陽性對照（紅蓋） Positive Control | 2管 | 5管 | 4°C |
陰性對照（白蓋） Negative Control | 0.2mL | 0.5mL | 4°C |
酶標二HRP-Conjugated Antibody Solution | 24mL | 58mL | 4°C |
10X稀釋液10X Diluent Solution | 12mL | 28mL | 4°C |
檢測稀釋液 Assay Diluent | 20mL | 50mL | 4°C |
20X洗板液 20X Wash Solution | 56mL | 120mL | 4°C |
T底物 T Substrate | 24mL | 58mL | 4°C |
終止液 S Solution | 24mL | 58mL | 4°C |
備注：如果試劑盒過一個月不使用建議性對照和酶標二-20°C儲存。
三、試劑以及樣品制備
1X稀釋液：用9體積的蒸餾水稀釋1體積的10X稀釋液，得到1X稀釋液。
1X洗板液：用19體積的蒸餾水稀釋1體積的20X洗板液，得到1X洗板液。
樣品血清/血漿預稀釋：在血清稀釋板上使用1X稀釋液將樣品血清稀釋10倍，例如將20uL的血清加入到180uL的1X稀釋液中混勻，備用。
陽性對照：取出回溫30分鐘后，每管加入65ul 1X稀釋液，振蕩混勻后備用，不使用時放于-20°C儲存，反復凍融應不多于3次。
四、實驗操作
試劑 | 每孔用量 |
檢測稀釋液 | 90 ul |
樣品/對照 | 10 ul |
酶標二 | 100 ul |
1X洗板液 | 2 ml |
底物 | 100 ul |
終止液 | 100 ul |
1. 實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出回復室溫；
2. 設置好對照及樣品在原包被板的位置，孔中加入90ul 檢測稀釋液；
3. 加入10ul的陽性對照到原包被板兩個孔中；
4. 加入10ul的陰性對照到原包被板的另外兩個孔中；（將陰性和陽性對照血清分隔加入，例如左上方加陽性對照，右下方加陰性對照）
5. 其他孔加入10ul預稀釋的血清樣品（已經預稀釋了1:10）.
6. 輕微振蕩1分鐘；
7. 封板，25°C孵育45分鐘；（注意避免陽光直射和空氣進入板中）
8. 棄去板中的液體；
9. 每孔加入250ul洗滌液洗板5次，請把板孔拍干；
10. 每孔加入100uL酶標二，封板，25°C暗處孵育30分鐘；
11. 每孔加入250ul洗滌液洗板3次，請把板孔拍干；
12. 每孔加入100uL的T底物，室溫下暗處孵育20分鐘；
13. 每孔加入100uL終止液，然后酶標儀450nm讀數；
五、結果判斷
樣品PP值=（樣品OD值÷陽性對照OD值）*100
性：陰性對照的PP值須小于40%，陽性對照OD值的平均值須≥0.7
陰性：樣品的PP值小于40%，樣品血清中體陰性
陽性：樣品的PP值大于40%，樣品血清中體陽性
六、 問題與解決
1.標準品無顏色變化或者無相應數值
可能原因 | 解決方法 |
試劑使用順序混亂，或者操作步驟出錯。 | 遵循實驗說明重復實驗。 |
使用了失效的酶標原， | 酶標原來自同一試劑盒，同一批次 |
T底物失效。 | 使用新的T底物。 |
2.低吸光度（OD值）
可能原因 | 解決方法 |
試劑過期，或者不同的批次混用。 | 查證過期試劑和批次。 |
洗液配制錯誤。 | 使用試劑盒提供的洗液，正確配制。 |
過多次洗滌。 | 按照說明書要求進行洗滌。 |
孵育時間過短。 | 按照說明書要求，嚴格計算好時間。 |
實驗室溫度過低。 | 保持實驗室溫度在（22.5±2.5）°C不要在空調風口或者寒冷的窗戶旁進行實驗。 |
試劑或者微孔板溫度過低。 | 試劑或者微孔板回溫，在實驗開始前，將試劑放置盒子外少1小時。 |
使用錯誤波長讀數，或者酶標儀失靈。 | 450nm波長讀數，檢查酶標儀。 |
試劑盒處于端的條件。 | 檢查試劑盒從冰箱拿出使用的次數，檢查試劑盒是否放置端溫度（過冷或者過熱）時間太長。 |
酶標板損壞 | 酶標板一直放置于有干燥劑密封的鋁箔袋中置于冰箱保存，回溫時也是放于鋁箔袋回到室溫。 |
3.過高的背景值或吸光度（OD值）
可能原因 | 解決方法 |
使用了質量差的水。 | 如果使用的水可疑，嘗試使用蒸餾水配制洗液。 |
底物失效。 | 加入微孔板前，底物是無色的。 |
洗滌不當或者洗板機洗板效果不好。 | 采用說明書建議的洗滌次數，每次每孔至少加入250μL洗液。檢查洗滌系統，排除故障。 |
酶標儀失靈。如果OD值讀數很高而顏色很淺，那個這是可能的情況。 | 使用校正微孔板檢查酶標儀，檢查光源。 |
實驗室溫度過高。 | 保持實驗室溫度（22.5±2.5）°C，避免在熱源或者陽光直射處實驗。 |
試劑混淆，被污染或者配制不當。 | 使用正確的試劑，準確配制，避免污染。 |
